蓝耳病(PRRS)是导致全球养猪业巨大经济损失的重大疫病之一。由于对PRRSV以及对机体的抗病免疫机理研究不够全面、不够深入,由于可用于防控PRRS的工具不够完美,在过去的二十多年里,世界范围内对PRRS采取的多种防控措施,都没能收到很好的经济回报。随着科技的进步,对PRRS及其病原认识的不断深入,一些更完美、更有效的工具陆续问世,PRRS将不再是养猪企业最头疼的疫病,操作更简单的免疫净化措施将为企业带来更高的投资回报。
一、蓝耳病免疫净化的“双阴”标准
PRRS免疫净化标准是“蓝耳病双阴标准”,即抗原阴性、感染抗体阴性。抗原阴性,就是不能从组织和血液中分离到病毒颗粒,或检测到病毒核酸(用RT-PCR检测);感染抗体阴性,就是病毒的核衣壳(N)蛋白抗体阴性,爱德士ELISA S/P<0.4。
二、蓝耳病自愈自净的特点是免疫净化的基础
1、蓝耳病的定义。蓝耳病学名“猪繁殖与呼吸障碍综合征”,英文名Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,简称PRRS。
2、PRRS的主要临床症状,突出表现有四个方面:
1)、在母猪主要表现为繁殖障碍综合征Reproductive Syndrome,特征性临床表现是怀孕后期的流产,返情、复配、死胎、木乃伊的比例也比正常情况下的高。
2)、在生长育肥猪及成年猪主要表现为呼吸障碍综合征Respiratory Syndrome,特别是在9~12周龄,感染猪的呼吸道问题明显突出。
3)、PRRSV主要侵害免疫系统、破坏免疫功能,导致机体的免疫抑制,使感染猪并发或继发其他病原体,如圆环病毒、猪肺炎支原体、巴士杆菌、副猪嗜血杆菌、链球菌等,由此,PRRSV也成为猪呼吸道疾病综合症(Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC)的主要病原之一;PRRSV感染也可以导致其他疫苗免疫效果降低甚至免疫失败,如对猪瘟疫苗、口蹄疫疫苗、伪狂犬疫苗等。
4)、实际上,PRRSV还可以导致消化道疾病如仔猪腹泻,最近报道的类NADC-34,主要导致感染猪的腹泻。
3、猪只感染PRRSV后,机体就发生了一系列的免疫学变化。
1)、有研究表明,猪只感染PRRSV后,病毒就在体内复制,很快就能在血液中检出病毒,病毒血症持续时间大约1个月,组织内病毒存续时间比在血液中要长,大约5个月;病毒感染不久机体即产生抗体反应。ELISA 总抗体维持1年左右;病毒中和抗体产生时间比较晚,大约在感染后4周,维持时间也比较短,大约3~5个月;γ-干扰素产生细胞出现的时间比较晚,大约在感染后4周,但其维持的时间比较长,1年甚至更长。
图1、猪只感染PRRSV后的系列免疫学变化
Temporal sequence of events after infection of a pig with PRRSV(Department of Veterinary and Biomedical Sciences South Dakota State University)
2)、此外,还有资料更详细分析了机体感染PRRSV后5周内发生的系列免疫学变化:感染猪血液中的病毒载量比组织中的高,病毒血症维持5周左右,尽管在病毒感染后前4周组织内的病毒载量比血液低,但其存续时间却比在血液中更长,有“低载量长时间”的特点;与病毒感染同时出现的是NK细胞(自然杀伤性细胞),1周后达到峰值,4周后下降到正常水平;树突细胞反应和局部T细胞反应在感染后2~3天出现,分别在感染1周和2周后达到最高水平,随后缓慢下降;外周血T细胞反应出现比较晚,大约在感染后2周多出现,5周后达到峰值,随后缓慢下降;病毒中和抗体产生最晚,大约在感染后3周多才出现。
图2、猪只感染PRRSV后的系列免疫学变化
Temporal sequence of immunobiological events after PRRSV infection in pigs(Vet Res 2020)(Salik Nazki College of Veterinary Medicine Jeonbuk National University, Iksan, South Korea)
根据“PRRSV感染后病毒血症大约4周左右消失、组织内的病毒大约5个月左右消失”可知,PRRS发展经过一段时间后自己就痊愈了,也就是说,PRRS就像猪流感一样能自愈。
当然,个体与群体的痊愈过程所受影响因素是有差异的。个体的痊愈过程主要受感染日龄、机体的免疫力、所感染病毒毒力、以及生物安全措施的执行情况等因素的影响,因此,发病过程短;群体的痊愈过程受影响因素较多,如群体的健康状况、免疫力水平、所感染病毒种类及毒力、病毒的传播速度、感染的季节、所采取的生物安全措施、群体的流动频率以及个体之间的差异等因素的影响。因此,群体的痊愈过程更复杂、周期更慢长。
因此,免疫的目的就是提高群体的免疫力水平、缩短个体之间的差异、干预群体疫病的感染、发生发展、流行和转归,缩短群体疫病的流行周期,缩短群体的痊愈过程。
过去采用的PRRSV野毒驯化或者PRRS活苗免疫的方式,能够缩短疫病流行过程,但它不是最究竟的PRRS控制净化措施。
野毒驯化或活苗免疫的本质也是人为干预猪群PRRS的感染、发生发展、流行和转归,抑制PRRS的大流行发生,减少其对生产的不利影响,特别是减少母猪群的流产风暴。
但是,PRRS是免疫缺陷疫病,活疫苗的毒力尽管已经降低,但它还是活病毒,还会感染免疫细胞,导致免疫缺陷。因此,对这种免疫缺陷疫病,野毒驯化或者活疫苗免疫不是最究竟的措施,我国二十多年的蓝耳病防控实践也证明了这一点。第一、野毒驯化或者活疫苗免疫不能彻底解决PRRS问题;第二、野毒或者疫苗毒的存在,为病毒扩散、病毒重组、毒力返强等提供机会;第三,猪是经济价值有限的动物,发病及发病过程稍长都影响养猪的经济效益。
4、为了提高群体对PRRS的抗病免疫水平,必须了解PRRSV的主要免疫保护相关结构蛋白。从病毒结构示意图可以看出,核衣壳(N)蛋白位于病毒颗粒内部,与核酸相连,病毒表面囊膜上还有基质蛋白M,小囊膜蛋白E,多聚蛋白GP2、GP3、GP4、GP5等,还有GP5/M二联体,GP2a/E/GP3/GP5多联体。
5、这些病毒囊膜上的结构蛋白与病毒侵入宿主细胞有关。多聚蛋白GP5不直接与宿主细胞的PRRSV主要受体CD163相互作用,因此,多聚蛋白GP5本身并不决定病毒对宿主细胞的取向。但GP5通过与M蛋白形成(GP5+M)二联体,影响 GP2-GP3-GP4多蛋白复合物的构象,间接影响病毒与宿主细胞CD163受体结合,进而影响病毒穿透细胞膜、进入细胞而引发感染。
图3、多聚蛋白GPS与宿主细胞受体CD163间的关系
6、由于GP5+M蛋白二联体在病毒侵入宿主细胞过程中起着重要作用,因此,找出GP5+M蛋白二联体上的中和表位(epitope)就显得十分关键。有研究表明,PRRSV主要的中和表位位于多聚蛋白GP5的外结构域上。GP5蛋白的中和表位的最小抗原性区域,包括主要中和表位,核心的氨基酸是第39至59段。GP5蛋白由200个氨基酸组成,其表位是构象表位;基质白M由190个氨基酸组成,GP5与 M蛋白通过二硫键形成二聚体,保证了GP5上中和表位的构象。
图4、GP5-M蛋白上的中和表位(epitope)
7、GP5蛋白上存在诱骗表位(decoy epitope),个别糖化氨基酸遮蔽了中和表位,使得蓝耳病毒在体内产生抗体弱,出现时间慢,容易逃避宿主的免疫清除,中和抗体在体外对病毒的中和也大打折扣,不能真实反应中和抗体的滴度和在体内的实际作用。
8、与PRRS免疫净化相关的主要有两种重要抗体:GP5+M蛋白抗体;核衣壳(N)蛋白抗体。
有研究表明,GP5+M蛋白在病毒侵入宿主细胞时发挥重要作用,GP5+M蛋白抗体可抑制病毒感染细胞,具有病毒中和作用,也称病毒中和抗体。病毒侵入机体,在其繁殖过程中产生大量GP5+M蛋白,由于多聚糖屏蔽作用,感染早期几乎很少诱导产生抗体,但1个月后也能诱导高水平的GP5+M蛋白抗体;普通灭活疫苗,囊膜上的GP5+M蛋白的抗原表位被多聚糖屏蔽,没有暴露,不产生中和抗体。GP5+M蛋白抗体可用HIPRA试剂盒检测 IRPC值,判断中和抗体水平高低。
核衣壳(N)蛋白位于病毒颗粒内部,与核酸相连。活病毒侵入后,在宿主细胞内大量繁殖,病毒核酸也大量复制,同时生产大量核衣壳(N)蛋白,进而诱导机体产生高水平核衣壳(N)蛋白抗体。灭活病毒不感染宿主细胞、不繁殖、核酸不复制,因此,核衣壳(N)蛋白含量极低,几乎不能诱导机体产生核衣壳(N)蛋白抗体,即便能产生,其水平也极低、消失也很快。因此,核衣壳(N)蛋白抗体,又称感染抗体,可用IDEXX ELISA 试剂盒检测其S/P值,根据比值大小判断感染与否或感染轻重。当S/P≥2.0的样本数超过10%时,表明猪群PRRS活跃;2.0>S/P≥0.4,表明猪群PRRS阳性稳定;S/P< 0.4,表明猪群PRRS阴性。
PRRS灭活疫苗免疫效果实验室检测的情形与检测PRV基因缺失疫苗的情形相似,PRRSV的核衣壳(N)蛋白抗体类似于PRV的gE/gI抗体,用于判断是否有活(野)毒感染;PRRSV的GP5+M蛋白抗体类似于PRV的gB抗体,用于判断免疫保护水平高低。
三、为免疫净化蓝耳病而设计的蓝泰莱
加速PRRS的痊愈过程是蓝泰莱研发的技术路线。要达到加速痊愈过程的目的,就必须清除感染猪体内的病毒;要清除体内的病毒,就必须有超强的细胞免疫力,以清除被病毒感染的细胞和细胞内的病毒,还必须有超强的体液免疫力,以清除细胞外的病毒;要实现超强的细胞免疫力和体液免疫力,疫苗的有效抗原含量就必须很高,此外,还必须有“双促进”作用的疫苗佐剂。为了提高疫苗的有效抗原含量,一方面要对种毒进行克隆、对细胞进行改造、筛选最优培养基,以提高制苗病毒的滴度,另一方面,要充分暴露病毒颗粒上的淋巴细胞识别位点即抗原位点,以提高病毒的抗原性,二者缺一不可(见图5)。
图5、蓝泰莱研发技术路线
四、蓝泰莱更是匠心打造出来的
蓝泰莱的研发技术路线确定后,按技术路线,反复打磨产品生产工艺的每一细节,也很重要。
通过无数次病毒克隆试验,筛选出了高产制苗病毒、高产培养细胞、高产培养基,筛选出了能充分暴露抗原位点提高抗原性(antigenicity)的病毒灭活剂及灭活工艺,筛选出了能同时促进细胞免疫和体液免疫的“双促进”疫苗佐剂,以及疫苗组方和疫苗乳化工艺。
前面已经讲到,PRRS野毒和活疫苗病毒在细胞内能不断繁殖,病毒核酸不断复制、核衣壳(N)蛋白不断增加,其诱导的N蛋白抗体水平也很高;而灭活疫苗中的病毒是死的,不能繁殖、核酸不能复制,因而不产生N蛋白,灭活疫苗中的N蛋白含量也很低,几乎不能诱导产生N蛋白抗体。由此可以建立,通过比较N蛋白抗体 S/P比值的高低,来区分灭活疫苗免疫与野毒感染的鉴别方法及免疫效果的评估方法。
五、蓝泰莱具有无以伦比的优势
通过无数次试验,蓝泰莱的制苗病毒,灭活前滴度达到 TCID50108.5 的世界先进水平;筛选出来的特殊灭活剂及灭活工艺,能让制苗病毒表面的抗原表位得到充分暴露,使疫苗的抗原性(antigenicity)更强;筛选出来的疫苗佐剂,也能真正实现细胞免疫和体液免疫 “双促进”的作用,大大提升了蓝泰莱诱导产生的免疫保护力;利用已有的实验室检测手段建立起来的,区分灭活疫苗免疫与活疫苗(野毒)感染的鉴别方法以及免疫效果的评估方法,在实验室和临床实践中都得到了充分验证;PRRSV感染猪免疫蓝泰莱后,真正达到了重整被PRRSV破坏的免疫系统,同时增强免疫猪的细胞免疫力和体液免疫力,高效清除体内PRRSV的目的,真正满足了猪场“紧急免疫治疗、预防控制、免疫净化”等功能全面覆盖的要求。
1)、蓝泰莱几乎不诱导免疫抑制因子(IL-10,TGF-β)产生
与进口活疫苗诱导产生高水平免疫抑制因子相反,蓝泰莱分别在注射6小时、和24小时后几乎不诱导免疫抑制因子(IL-10,TGF-β)的产生,说明免疫蓝泰莱不会产生免疫抑制(见图6)。
图6、蓝泰莱与进口活疫苗免疫后诱导产生免疫抑制因子浓度对比
2)、蓝泰莱同时诱导高水平细胞免疫力和体液免疫力
与普通灭活疫苗相比,蓝泰莱免疫后,不同时间段的细胞因子的表达量更高,说明蓝泰莱的细胞免疫力更强(见图7)。
图7、蓝泰莱与普通蓝耳灭活疫苗诱导的细胞因子相对表达量
体液免疫力可以粗略地用中和抗体水平(IRPC值)表示,普通蓝耳病灭活疫苗,无论是首次免疫还是加强免疫都不诱导产生中和抗体;而蓝泰莱,在首次免疫14天后就能产生较高水平的中和抗体,二免后中和抗体水平再次拉升,完全
符合疫苗免疫应答规律,说明蓝泰莱的体液免疫力更强(见图8)。
图8、蓝泰莱与普通蓝耳灭活疫苗诱导的中和抗体水平比较(海博莱试剂盒IRPC值)
3)、蓝泰莱可以高效清除攻毒猪血清中的蓝耳病毒
相隔21天,两次蓝泰莱免疫,二免28天后,用PRRSV对免疫猪进行攻毒,攻毒后,连续多次检测攻毒猪血清中的病毒载量,结果,攻毒14天后就不能在血清中检出病毒核酸,表明蓝泰莱可以高效清除攻毒猪血清中的病毒(见图9)。
图9、蓝泰莱免疫猪蓝耳病毒攻毒后血清中的病毒载量变化
表1、蓝泰莱免疫PRRS双阴母猪能产生良好的中和抗体
表2、蓝泰莱免疫PRRSV阳性母猪感染抗体逐渐转阴
六、用蓝泰莱免疫净化操作更简单
有了蓝泰莱这一好工具,蓝耳病的免疫净化工作就来的相当简便,可以说是简单粗暴。
1、全场全面停止使用所有PRRS减毒活疫苗。
2、做好生物安全工作,特别要做好种精的病原检测工作,尽量减少引种次数、降低引种频率,如确实需要从外部引种猪,引进的种猪必须在隔离场或隔离栏舍隔离饲养观察。
3、对饲养在隔离场的引进种猪,应分别在第1天、第21天进行两次蓝泰莱免疫。种猪在第二次免疫后4周,经检测达到“蓝耳双阴”标准后方可与本场其他种猪混群饲养。
4、对种公猪、种母猪,建议集中统一免疫,即第1天、第21天两次免疫,以后每隔3个月重复免疫,每次每头猪肌肉注射2.0毫升。
5、对仔猪和小猪,要分两种情况。对蓝耳阴性猪场或阳性稳定猪场,建议在35日龄,和65日龄,进行两次免疫接种,每次每头猪肌肉注射1.0毫升,这种免疫模式简称“365模式”;对蓝耳阳性活跃猪场或者发病猪场,建议在15日龄、35日龄、和65日龄,进行三次免疫接种,每次每头猪肌肉注射1.0毫升,这种免疫模式简称“1365模式”。
七、免疫净化效果评估方法公平公正
蓝泰莱的免疫效果首先表现在生产成绩的极大改善。蓝泰莱免疫一段时间后,猪场不再出现PRRS各种临床症状和解剖病变,其他细菌性感染,如猪肺疫、副猪嗜血杆菌感染、链球菌感染等都少了,猪气喘病也少见了,随之而来的,用于治疗或预防各种细菌感染的各种药品费用也明显减少、饲料消耗也明显降低,各项生产指标也得到大大改善,商品猪上市时间也大大缩短。
蓝泰莱的免疫效果还可以进行实验室检测。蓝泰莱免疫一段时间后,实验室检测各项指标,包括PRRS“双阴指标”都必须符合要求:血清中的病毒载量逐渐下降直至不能检出,可用RT-PCR检测;血清中的感染抗体水平逐渐下降直至转阴,可用IDEXX ELISA试剂盒检测N蛋白抗体S/P值;血清中的病毒中和抗体(GP5+M蛋白抗体)水平保持在一个合理区间,如IRPC值100~300,可用HYPRA试剂盒检测;反映细胞免疫力水平的CD4+T细胞,CD8+T细胞和γ-干扰素的表达量,都明显提高,可以用流式细胞仪检测。
要注意的是,在进行血清学检测时,必须连续多次采样检测,然后再对前后多次的检测结构进行对比分析。
八、蓝泰莱免疫净化的投资回报更高
蓝泰莱免疫净化的投资回报体现在如下5个方面:
1、安全系数高:不像减毒活疫苗存在疫苗毒致病的风险,存在散毒、毒力返强、与其他毒株杂交重组的风险;蓝泰莱没有活病毒、没有散毒、返强、杂交重组的风险。
2、无转阳风险:免疫净化获得的“蓝耳双阴”猪群,由于有免疫保护力,因此,不会像“闭群净化”获得的“蓝耳双阴”猪群一样存在“阴转阳”可能性,导致猪群生产成绩波动较大、母猪群出现流产风暴的风险。
3、净化周期短:与“闭群净化”相比,免疫净化达到净化的时间更短,在一个生物安全措施执行得比较好、猪群流动也有效控制的前提下,实现蓝耳病净化的目标大约需要12个月左右。
4、各种耗资少:与“闭群净化”相比,免疫净化不用反复全群采样检测,不用大量淘汰阳性猪只,相应地它所需要的各种费用也比就少。
5、生产成绩最好:“蓝耳双阴”猪群,由于没有了蓝耳病及其继发感染的影响、没有了免疫抑制,优良种猪生产性能得到了充分发挥,大大减少了饲料消耗,缩短了生产周期。
蓝泰莱自2021年9月上市以来,已有219家大型、特大型养猪场在使用。它们代表了不同的地区、感染不同的毒株如经典毒、变异毒、包括新出现的类NADC-30/34、以及采用不同处理措施的各种情形。这些猪场换成蓝泰莱后,在紧急免疫治疗、预防控制和免疫净化PRRS上都取得了惊人的成绩,明显优于其他同类产品,可以说是出类拔萃。养猪企业也因此获得更高、更直接的投资回报。
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